تخلیص و شناسایی ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم تریپسین حاصل از امعاء و احشاء ماهی کیلکای معمولی دریای خزر (clupeonella cultriventris caspia)

در این تحقیق آنزیم تریپسین از ضمائم پیلوریک ماهی کیلکای معمولی دریای خزر از طریق راسب سازی با آمونیوم سولفات (60-30 درصد)، کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون (سفادکس جی 75) و تعویض یونی (دی اتیل آمینو اتیل – سلولز) تخلیص گردید. میزان تخلیص تا 3/28 برابر و میزان بازده تا 12درصد بدست آمد. وزن مولکولی تریپسین تخلیص شده بر اساس سدیم دو دسیل سولفات- پلی اکریل آمید ژل الکتروفورزیز(sds-page) 2/23 کیلودالتون بود و بر اساس native-page وsubstrate-gel الکتروفورزیز فقط دارای یک ایزوفرم بود. شناسایی ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم تریپسین تخلیص شده از ضمائم پیلوریک ماهی کیلکای معمولی دریای خزر (ckt) و آنزیم پانکراتیک خوک (pt) نشان داد که دما و ph بهینه برای هر دو آنزیم به ترتیب c°60 و 8 بود. پایداری دمایی برای آنزیم تریپسین ckt تا c° 45 و برای pt تا c°50 بود. پایداری ph برای آنزیم تریپسین ckt در محدوده 10-7 و برای آنزیم تریپسین خوک در محدوده 11-4 قرار داشت. فعالیت آنزیم تریپسین cktو pt در برابر مهارکننده های sbti و tlck کاهش معنی داری را با نمونه شاهد که فاقد مهارکننده بود نشان دادند بطوریکه درckt این مهارکنندگی به 100 درصد رسید (05/0>p). pmsf و پاراآمینوبنزآمیدین نیز باعث مهارکنندگی معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین درckt و pt گردیدندکه با نمونه شاهد اختلاف معنی داری را نشان داد (05/0>p). مهارکننده های tpck و بتامرکپتواتانول هیچگونه اثر مهارکنندگی بر روی آنزیم تریپسین ckt نداشتند (05/0> p) ولی درpt کاهش معنی داری را در فعالیت آنزیم تریپسین ایجاد نمودند (05/0> p). پپاستاتین a، یدواستیک اسید و edta اثر مهارکنندگی معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین در ckt و pt نشان ندادند (05/0p). یون های سدیم و پتاسیم تاثیری در فعالیت آنزیم تریسینckt نداشتند (05/0p). سورفاکتانت ها به استثنای سدیم دو دسیل سولفات (sds) اثر افزایشی معنی داری بر فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt نسبت به نمونه شاهد داشتند (05/0>p) در حالیکه sds باعث کاهش معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt نسبت به نمونه شاهد گردید (05/0>p). عوامل اکسیدکننده پراکسید هیدروژن و سدیم پربورات باعث کاهش معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt نسبت به نمونه شاهد گردیدند (05/0>p). مطالعه کینتیک آنزیم تریپسین cktو pt نیز نشان داد که مقدار ثابت میکائیلیس-منتن (km) برای آنزیم تریپسین ckt بطور معنی داری کمتر از pt بود (05/0>p). ثابت کاتالیزوری (kcat) و کارایی کاتالیزوری(kcat/km) ckt بطور معنی داری بیشتر از pt بود (05/0>p). نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئاز تخلیص شده از ضمائم پیلوریک ماهی کیلکای معمولی با توجه به اثر مهارکنندگی کامل مهارکننده های اختصاصی sbti و tlck، آنزیم تریپسین بوده و از آنجائیکه این آنزیم در برابر pmsf که یک مهارکننده پروتئازهای سرین می باشد، دچار افت فعالیت گردید، بنابراین پروتئاز تخلیص شده یک پروتئاز سرین است.